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激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項

2010年11月24日 09:53:57人氣:976來源:上海銳谷生物科技有限公司

《一》制備高特異性和價的熒光抗體
 
    標本只有在用熒光探針標記的前提下才能進行共聚焦顯微鏡檢測.制備高特異性和價的熒光抗體是檢測的關鍵。這就要求選用高質量的熒光素和高特異性與價的免疫血清。同時還要對熒光抗體進行質量鑒定,主要是進行特異性和敏感性鑒定。
 
《二》標本制作要求
 
    1.標本厚度  組織切片或其他標本不能太厚,否則激發光多數消耗在標本下部,而物鏡觀察的上部不能被充分激發。
 
    2.載玻片  載玻片要光潔,無自發熒光;載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間,太厚會吸收較多的光,不能使激發光在標本上聚焦。
 
    3.封固劑  甘油必須無色透明,無自發熒光。由于熒光在pH 8.5~9.5時較亮,不易很快退去,常用甘油加入0.5mol/lpH 9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液封片。
 
《三》定量研究的要求
 
    1.隨機性
    (1)在感興趣區域內隨機抽樣,不能主觀地選擇一些便于定量的“理想切片”,這種“理想切片”不能代表所要研究的整體區域。
    (2)在隨機抽取的切片上,應隨機抽取觀察視野。
    (3)在隨機抽取的視野中,通過連續觀察“光學切片”,得到感興趣結構的三維定量信息。如果不能連續觀察“光學切片”,需要在Z軸方向隨機抽樣,然后作定量研究。
 
    2.避免參照陷阱  如果獲得的資料是密度信息,當比較各組參照空間(包含待測結構的區域)的體積不同時,根據密度信息可能得出錯誤結論。因此,需要注意所謂的參照空間“陷阱”問題。
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