士鋒生物豬瘟單克隆抗體ELISA方法試驗介紹

時間：2014-1-2閱讀：753

（一）材料及試劑
1．豬瘟單抗純化抗原
2．兔抗豬IgG酶標抗體
3．豬瘟陽性血清
4．豬瘟陰性血清
1～4均由的生物制品所購買。
5．elisa反應板
6．包被液
碳酸鈉 1.50g
2.93g
H2O加至 1 000ml
pH值9.6
7．PBS液
氯化鈉 8.90g
磷酸二氫鉀 0.20g
無水 2.13g
加雙餾水 1 000ml
8．PBS－吐溫洗滌液
PBS液 1 000ml
犢牛血清 5ml
混合即可
9．底物溶液
⑴ 0.1Mol/L檸檬酸液
檸檬酸 21g
雙蒸餾水加至 1 000ml
⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.6g
雙蒸餾水加至 1 000ml
⑶ pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液
取⑴液 24.30ml
⑵液 25.70ml
混勻即可
⑷鄰苯二胺液
取⑶液 50ml
雙餾水 50ml
磷苯二胺 20mg
30%H2O2 0.15ml
待鄰苯二胺溶化后再加H2O2，現用現配。
10．終止液
濃H2SO4(98%) 22.2ml
H2O 177.80ml
（二）操作方法
1．用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯抗原各做100倍稀釋，每孔包被100µl，4℃濕盒過夜。
2．次日取出，甩去孔內液體，3×3′沖洗。
3．將待檢血清以PBS液做400倍稀釋，每孔加100µl同時將豬瘟陽性血清、豬瘟陰性血清各做100倍稀釋，于對照孔中加100μl。37℃溫育1.5h～2h。
4．重復第二步，取出，甩去孔內液體，3×3′洗滌。
5．將兔抗豬IgG酶標抗體以PBS液做100倍稀釋，每孔加100μl，37℃溫育1.5h～2h。
6．重復第4步。
7．每孔加底物溶液100µl，室溫下觀察顯色反應。當陰性對照孔稍顯色時，立即終止反應，并以陰性孔做空白對照。
8．每孔加終止液50µl立即于酶聯免疫吸附檢測儀測定490nm波長的光密度。
（三）結果判定
在豬瘟弱毒酶聯板上，OD≥0.2，為豬瘟弱毒抗體陽性；OD＜0.2，為豬瘟弱毒抗體陰性。
在豬瘟強毒酶聯板上，OD≥0.5，為豬瘟強毒抗體陽性；OD＜0.2，為豬瘟強毒抗體陰性。

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