PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內部形成二級結構；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

產品名稱：溶藻弧菌探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：Vibrio alginolyticus
貨號：XG01P4235
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。

熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
實時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號  反應物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

人黑色素瘤細胞英文名稱：M14

LoVo(人大腸細胞)5×106cells/瓶×2

內皮型一氧化氮合酶(NOS3)重組蛋白英文名稱：Recombinant Nitric Oxide Synthase 3, Endothelial (NOS3)

70kDa熱休克蛋白1樣蛋白(HSPA1L)重組蛋白英文名稱：Recombinant Heat Shock 70kDa Protein 1 Like Protein (HSPA1L)

小鼠肝動脈內皮細胞*培養基100mL

MS培養基/MS MediumBR10升國產/進口

戊烷脒加入戊烷脒多粘菌素瓊脂50毫克國產/進口

人成纖維肉瘤細胞英文名稱：HT1080

HL-60(人早幼粒急性白血病細胞)5×106cells/瓶×2

胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)重組蛋白英文名稱：Recombinant Insulin Like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP3)

胰島素樣生長因子1(IGF1)重組蛋白英文名稱：Recombinant Insulin Like Growth Factor 1 (IGF1)

鹽皮質激素受體(MR)重組蛋白英文名稱：Recombinant Mineralocorticoid Receptor (MR)

血小板因子4(PF4)重組蛋白英文名稱：Recombinant Platelet Factor 4 (PF4)
溶藻弧菌探針法熒光定量PCR試劑盒3-氟-5-(三氟甲基)

3-氟-5-(三氟甲基)

反式-(m)-雙[2-(鄰甲苯基膦)芐基]乙鈀(II)

反式-(m)-雙[2-(鄰甲苯基膦)芐基]乙鈀(II)

(溴甲基)環丁烷

(溴甲基)環丁烷

2,3-噻吩

2,3-噻吩

3-噻吩

3-噻吩

基因反應體系：
序號  反應物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內參照上游引物F  0.5μl
3  內參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。