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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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鮭魚(yú)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒固體樣本的收集
2020-3-11 閱讀(216)
鮭魚(yú)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) ELISA試劑盒固體樣本的收集：
1、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取 1g 組織，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。分裝一 份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對(duì)于植物組織，不好勻漿的話，就在液氮中充分研磨。
2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。
（1）培養(yǎng)的細(xì)胞
A、動(dòng)物細(xì)胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融（如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
B、植物細(xì)胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎 2s，冷卻 30s 的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
（2）組織的細(xì)胞
切割標(biāo)本后，稱取 1g 組織，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），去除上清，再用 pH7.2-7.4左右的 PBS 小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。
3、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。
4、咽拭子：加入 2ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白，直接取上清檢測(cè)，測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。
5、植物標(biāo)本：取組織塊（0.2g～0.5g）少可到 5～10mg 在冰冷的 PBS 中漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱重，放入 5ml 的勻漿管中；按重量(mg):體積(ml)=1:9 的比例加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊；勻漿的方式：手工勻漿，機(jī)器勻漿。 ① 手工勻漿：左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8 分鐘），充分研碎，制成 20%的勻漿液。 ② 機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī) 10000～15000 轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成 10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間 10 秒/次，間隙 30 秒，連續(xù) 3～5 次，在冰水中進(jìn)行,可適當(dāng)延長(zhǎng)勻漿時(shí)間），鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片（直接涂片、染色均可以），顯微鏡下觀察細(xì)胞是否破碎，若沒(méi)有則可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。將制備好的 10%勻漿液用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī) 4000 轉(zhuǎn)/分左右,離心 10～15 分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定。
