液相色譜法與薄層掃描法測定女貞子中*含量的比較

【資料簡介】

【摘要】  目的 研究用液相色譜測定女貞子中*含量的方法,并與薄層掃描色譜法比較。方法色譜柱為kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫30℃； 流動(dòng)相甲醇-水（85∶15）；流速0.7 ml?min-1；檢測波長為204 nm。結(jié)果*在0.645 6～4.304 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 9（n=5）,平均回收率為101.8%，RSD=0.75%。結(jié)論液相色譜法比薄層掃描色譜法更靈敏、簡便、準(zhǔn)確，精密度好。

【關(guān)鍵詞】  液相色譜法 薄層掃描色譜法 女貞子 *

A Comparison of HPLC with TLCS in Determination of Oleanolic Acid

LUO Duo?sheng , GUO Jiao, HE Wei, LI Yong

(Guangdong Pharmaceutical University ,Guangzhou 510006 ，China)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of the content of oleanolic acid , and compare the results by HPLC and TLCS. MethodsWith a kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm） at 30℃,methyl alcohol -water(85∶15) was used as the phase ,the flow rate was 0.7ml/min ,the wavelength was 204 nm.ResultsThe oleanolic acid had a good linear relationship with HPLC in the range of 0.645 6～4.304μg , r=0.999 9. The average recovery was 101.8%and RSD was 0.75%.ConclusionIt is proved that the HPLC is more reliable , simple, accurate and reproducible than TLCS is.

Key words：HPLC ;  TLCS;   Oleanolic acid；  Comparison

女貞子系木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)，主要成分為*、熊果酸、乙酰*、女貞子苷等［1］。具有補(bǔ)肝腎陰、烏須明目的功能。《中國藥典》2005年版Ⅰ部只對(duì)女貞子中的*采用薄層色譜法進(jìn)行定量控制［2］，但因女貞子中同時(shí)還含有熊果酸，為*的同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)極為相似，以薄層色譜掃描法定量時(shí)，*與熊果酸兩者無法分離導(dǎo)致含量測定不確。本文對(duì)液相色譜法與薄層色譜法測定女貞子中*含量進(jìn)行了比較。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1  儀器與試劑

WATERS 2695/2996型液相色譜儀（美國）；CAMAG TLC SCANNER3薄層色譜掃描儀（瑞士CAMAG）；UV-754型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）；ZF－2型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；*（110790－200304購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用）；硅膠G（青島海洋化工廠）；女貞子藥材（購自廣州致信中藥飲片有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純，純凈水，其他試劑均為分析純。

2  方法與結(jié)果

2.1  液相色譜法

2.1.1  對(duì)照品溶液的制備

精密稱取*對(duì)照品10.76 mg，加甲醇溶解，制成每毫升含0.538 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2  供試品溶液的制備

取女貞子粗粉約0.5 g（批號(hào)200510170），精密稱定，加乙醇25 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，藥渣加乙醇同上重復(fù)回流兩次，合并濾液，蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇微熱使溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3  zui大吸收波長的選擇

吸取*對(duì)照品溶液（0.538 mg?ml-1）1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，用紫外可見分光光度計(jì)，從200～400 nm全波長掃描，*zui大吸收波長為204 nm。見圖1。

2.1.4  色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱為kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相為甲醇-水（85∶15）；檢測波長為204 nm；流速0.7 ml?min-1；柱溫：30℃。自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。在此色譜條件下，得色譜圖見圖2～3。峰形對(duì)稱，理論板數(shù)以*峰計(jì)在3 000以上。

2.1.5  線性關(guān)系的考察

吸取對(duì)照品溶液1，2，5，10，15 μl，注入液相色譜儀中，按照上述色譜條件測定峰面積積分值。以*微克數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，求得直線方程為Y=1 006 577.61X－58 700.91，r= 0.999 9。線性范圍為0.645 6～4.304 μg。

2.1.6  精密度實(shí)驗(yàn)

吸取同一供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀中，測定峰面積積分值，連續(xù)6次，*峰面積積分值RSD＝0.75％（n=6）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.7  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀中，測定峰面積積分值，然后分別在2，4，8，24 h再進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，*RSD＝0.39％（n=6）。

2.1.8  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)20051017），按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定，測得RSD＝0.75％(n=6)。

2.1.9   回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的供試品（批號(hào)20051017）適量（相當(dāng)于*1.076 mg），加入*對(duì)照品2 ml，依法操作，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。平均回收率為101.8%，RSD為0.75%。表1  加樣回收率測定結(jié)果（略）

2.2  薄層掃描色譜法

2.2.1  色譜條件

展開劑為環(huán)己烷-丙酮-醋酸乙酯-甲酸 （5∶2∶1∶0.1）；顯色劑為10%硫酸乙醇溶液；掃描波長λs= 530 nm，λR=700 nm。

2.2.2  供試品溶液的制備

與“2.1.2”項(xiàng)下同。

2.2.3  對(duì)照品溶液的制備精密稱取*對(duì)照品10.76  mg，加甲醇溶解，制成每毫升含1.076 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4  線性關(guān)系的考察 吸取對(duì)照品溶液2，4，6，8，10 μl點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上掃描，按照上述色譜條件測定峰面積積分值。以*微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸收度積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程Y＝1620.7X＋1280.7，r＝0.9964，線性范圍為：2.02～10.1 μg。

2.3  結(jié)果分析

2.3.1  HPLC法取同一批樣品（批號(hào)：20051017）,按照“2.1.2”項(xiàng)下的供試品制備方法制備供試品溶液4份，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，每份重復(fù)測定2次，計(jì)算。測定結(jié)果見表2。

2.3.2  TLCS法分別吸取各供試品溶液6 μl，對(duì)照品溶液6，8 μl交叉點(diǎn)于同一薄層板上，按上述方法展開、掃描，測量供試品與對(duì)照品吸收度積分值，測定，計(jì)算，即得。色譜圖見圖4，結(jié)果見表2。表2  液相色譜法與薄層掃描色譜法含量測定結(jié)果比較（略）

由表2可以看出，對(duì)同一批樣品的含量測定結(jié)果液相色譜法小于薄層掃描色譜法。因*和熊果酸互為同分異構(gòu)體，TLCS無法分開，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。且由于顯色等諸多因素影響，同板與異板間含量測定結(jié)果差別較大，所以液相色譜法更為準(zhǔn)確。

3  討論

曾對(duì)甲酸?水（90∶10）、甲醇?水（85∶15）、乙腈?水（75∶25）、乙腈?甲醇?水（64∶20∶16）等不同流動(dòng)相做過對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水（85∶15）作流動(dòng)相即可得到滿意的色譜峰形，*與熊果酸峰形的分離度也較高。

《中國藥典》2005年版Ⅰ部對(duì)女貞子中的*采用薄層色譜法進(jìn)行定量控制，但因女貞子中同時(shí)還含有熊果酸，兩者是同分異構(gòu)體，均為齊墩果烷型的五環(huán)三萜類化合物，理化性質(zhì)極為相似，以薄層色譜掃描法定量時(shí)，*與熊果酸只顯示一個(gè)斑點(diǎn)，兩者無法分離從而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。而液相色譜法測定女貞子中*含量，*峰與熊果酸峰分離度大于1.5，理論板數(shù)以*峰計(jì)在3 000以上。

將*對(duì)照品溶液在紫外可見分光光度計(jì)上從200～400 nm全波長掃描，結(jié)果*在204  nm處有特征吸收，因此確定204 nm為*的檢測波長。

【參考文獻(xiàn)】

［1］季宇彬.中藥有效成分藥理與應(yīng)用［M］.哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1995:322.

［2］國家藥典委員會(huì).中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:31.