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PCR常見問題分析及對策(無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性)
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- 【資料簡介】
PCR常見問題分析及對策(無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性)
問題1:無擴(kuò)增產(chǎn)物
現(xiàn)象:正對照有條帶,而樣品則無
原因:
1.模板:含有抑制物,含量低
2.Buffer對樣品不合適
3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解
4.反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時(shí)間太短
對策:
1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更換Buffer或調(diào)整濃度
3.重新設(shè)計(jì)引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu))或者換一管新引物
4.降低退火溫度、延長延伸時(shí)間問題2:非特異性擴(kuò)增
現(xiàn)象:條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶
原因:
1.引物特異性差
2.模板或引物濃度過高
3.酶量過多
4.Mg2+濃度偏高
5.退火溫度偏低
6.循環(huán)次數(shù)過多
對策:
1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR
2.適當(dāng)降低模板或引物濃度
3.適當(dāng)減少酶量
4.降低鎂離子濃度
5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法
6.減少循環(huán)次數(shù)
問題3:拖尾
現(xiàn)象:產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因:
1.模板不純
2.Buffer不合適
3.退火溫度偏低
4.酶量過多
5.dNTP、Mg 2+濃度偏高
6.循環(huán)次數(shù)過多
對策:
1.純化模板
2.更換Buffer
3.適當(dāng)提高退火溫度
4.適量用酶
5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度
6.減少循環(huán)次數(shù)
問題4:假陽性
現(xiàn)象:空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物
原因:
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物
的交*污染
對策:
1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外;
2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管
及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。
3.各種試劑*行分裝,然后低溫貯存
PCR引物設(shè)計(jì)的黃金法則 (轉(zhuǎn)自tiangen)
1.引物在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。
DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件(比如DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)
2.引物長度一般在15~30堿基之間。
引物長度(primer length)常用的是18-27 bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
3.引物GC含量在40%~60%之間,Tm值接近72℃。
GC含量(composition)過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估計(jì)引物的Tm值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值接近72℃以使復(fù)性條件*。
4.引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴(kuò)增的特異性與效率。
5.引物3′端不能選擇A,選擇T。
引物3′端錯(cuò)配時(shí),不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,當(dāng)末位的堿基為A時(shí),即使在錯(cuò)配的情況下,也能有引發(fā)鏈的合成,而當(dāng)末位鏈為T時(shí),錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低,G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間,所以3′端選擇T。
6. 堿基要隨機(jī)分布。
引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)(False priming)。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布是隨機(jī)的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。
7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性,尤其應(yīng)避免3′ 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross dimer)的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話,應(yīng)盡量使其△G值不要過高(應(yīng)小于4.5kcal/mol)。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。
8. 引物5′ 端和中間△G值應(yīng)該相對較高,而3′ 端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能,它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性,△G值越大,則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′ 端和中間△G值相對較高,而3′ 端△G值較低(值不超過9)的引物。引物3′ 端的△G 值過高,容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。(不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析)
9.引物的5′端可以修飾,而3′端不可修飾。
引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物的長度,它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括:加酶切位點(diǎn);標(biāo)記*、熒光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列;引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列;引入啟動(dòng)子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開始的,不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。
10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。
某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響,選擇擴(kuò)增片段時(shí)避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件(比如RNAstructure)可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明,待擴(kuò)區(qū)域自由能(△G°)小于58.6l kJ/mol時(shí),擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí),用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。
11. 引物應(yīng)具有特異性。
引物設(shè)計(jì)完成以后,應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性,就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。
值得一提的是,各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物;用作克隆目的的PCR,因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定,引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次,盡量去滿足條件。
做Real Time時(shí),用于SYBR Green I法時(shí)的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。
引物設(shè)計(jì)的要求:
1)避免重復(fù)堿基,尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3)GC=30-80%.
4)3'端zui后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C.
5)正向引物與探針離得越近越好,但不能重疊。
6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度: 引物的產(chǎn)物大小不要太大,一般在80-250bp之間都可;80~150 bpzui為合適(可以延長至300 bp)。
7)引物的退火溫度要高,一般要在60度以上;
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。
而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力,即引物應(yīng)該跨外顯子,是引物能跨外顯子的接頭區(qū),這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設(shè)計(jì)軟件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。
做染料法zui關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物,你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不容易。
關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對,發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個(gè)引物,在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中,除了和你的目標(biāo)基因之外,還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列,如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列,則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物,那么這個(gè)引物的特異性就很差,從而不能用PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi),有些于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
一.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長度不 夠,引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。
物理原因:變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
1假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。
引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。
2出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有:①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
3出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
二.PCR污染與對策
PCR反應(yīng)的zui大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
污染原因
(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。
(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視,zui可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.
(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測
一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
對照試驗(yàn)
1.陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下),但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照。
2.陰性對照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括①標(biāo)本對照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測試劑是否污染。
3.重復(fù)性試驗(yàn)
4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
防止污染的方法
(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng),實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心,吸樣要慢,吸樣時(shí)盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,如有可能,PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù),避免污染機(jī)會。另外,PCR試劑,PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。
(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨栃詫φ找阅艹霈F(xiàn)擴(kuò)增條帶的zui低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。
(六)減少PCR循環(huán)次數(shù),只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。
(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入,打開離心管前應(yīng)先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕,以防管內(nèi)液體濺出。
2024世環(huán)會【工業(yè)節(jié)能與環(huán)保展】

div6月3日,2024世環(huán)會【工業(yè)節(jié)能與環(huán)保展】于上海丨國家會展中[詳細(xì)]
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