PCR常見問題分析及對(duì)策（無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性）

【資料簡介】

PCR常見問題分析及對(duì)策(無擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽性)
 

問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物
現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無    
原因:
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer對(duì)樣品不合適
3.引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解
4.反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短
對(duì)策:
1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更換Buffer或調(diào)整濃度
3.重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物
4.降低退火溫度、延長延伸時(shí)間

 

問題2：非特異性擴(kuò)增
 

現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶
原因：
1.引物特異性差
2.模板或引物濃度過高
3.酶量過多
4.Mg2+濃度偏高
5.退火溫度偏低
6.循環(huán)次數(shù)過多
對(duì)策：
1.重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR
2.適當(dāng)降低模板或引物濃度
3.適當(dāng)減少酶量
4.降低鎂離子濃度
5.適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法
6.減少循環(huán)次數(shù)
 

 

 

 

 

 

 

問題3：拖尾
現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。
原因：
1.模板不純
2.Buffer不合適
3.退火溫度偏低
4.酶量過多
5.dNTP、Mg 2+濃度偏高
6.循環(huán)次數(shù)過多
對(duì)策：
1.純化模板
2.更換Buffer
3.適當(dāng)提高退火溫度
4.適量用酶
5.適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度
6.減少循環(huán)次數(shù)
 

 

問題4：假陽性
現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物
原因：
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物
的交*污染
對(duì)策：
1.操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；
2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管
及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。
3.各種試劑*行分裝，然后低溫貯存  
 

 

PCR引物設(shè)計(jì)的黃金法則 （轉(zhuǎn)自tiangen）
1.引物在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。
DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)

2.引物長度一般在15~30堿基之間。
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值接近72℃。
GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值接近72℃以使復(fù)性條件*。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，選擇T。
引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端選擇T。

6. 堿基要隨機(jī)分布。
引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′ 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

8. 引物5′ 端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3′ 端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′ 端和中間△G值相對(duì)較高，而3′ 端△G值較低（值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記*、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。

10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。

11. 引物應(yīng)具有特異性。
引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
做Real Time時(shí),用于SYBR Green I法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。
引物設(shè)計(jì)的要求：
1)避免重復(fù)堿基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端zui后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C.
5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bpzui為合適（可以延長至300 bp）。
7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。
而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。
做染料法zui關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不容易。
關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個(gè)引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個(gè)引物的特異性就很差，從而不能用

 

 

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
一.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
　　模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
　　酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
　　引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
　　反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
　　物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。
1假陽性
　　出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
　　引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。
　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
2出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
　　PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
3出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
　　PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
二.PCR污染與對(duì)策  
    PCR反應(yīng)的zui大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
污染原因
　(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
　(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
　(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中zui主要zui常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
　還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.
　(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測
　一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
對(duì)照試驗(yàn)
　1.陽性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)，但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對(duì)檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。
　2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試劑是否污染。
　3.重復(fù)性試驗(yàn)
  4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
防止污染的方法
(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。
(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的zui低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。
(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。
(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。