端粒酶作為腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展

【資料簡(jiǎn)介】

摘要 zui近大量的研究表明細(xì)胞端粒酶激活是多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生的先決條件。端粒酶在惡性腫瘤組織及相關(guān)脫落細(xì)胞中檢出率很高，因此可作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物。
　　關(guān)鍵詞：腫瘤；標(biāo)志物；端粒酶
　　長(zhǎng)期以來(lái)，普遍認(rèn)為癌癥是由破壞細(xì)胞正常生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的多種基因突變引起。盡管不同的癌癥可能涉及到一個(gè)特定的基因突變，個(gè)體的癌癥往往表現(xiàn)為以多基因突變?yōu)樘卣鳌３诉@種特殊的病因?qū)W外，zui近的研究支持一種新的模式，即端粒酶的激活可能是許多惡性腫瘤發(fā)生的先決條件^[1]。

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　　1 端粒、端粒酶與細(xì)胞永生
　　端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其DNA的特殊是含有大量的（TTAGGG）n串聯(lián)重復(fù)并富含G的重復(fù)序列，這些序列在進(jìn)化中高度保守。端粒結(jié)構(gòu)功能主要有2個(gè)：一是可保護(hù)染色體基因組免受被降解或有害重組，其二是端粒重復(fù)可為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列以暫時(shí)緩沖或取消末端復(fù)制問(wèn)題所帶來(lái)的染色體DNA進(jìn)行性縮短。大多數(shù)普通體細(xì)胞的端粒會(huì)隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，zui終達(dá)到一個(gè)使染色體完整性喪失的臨界點(diǎn)，細(xì)胞增殖停止。說(shuō)明端粒的縮短與高等真核生物中正常體細(xì)胞增生受到限制相關(guān)，在細(xì)胞衰老中扮演“分裂鐘”的作用^[1]。
　　與體細(xì)胞不同，生殖細(xì)胞要為將來(lái)產(chǎn)生新的有機(jī)體而保存基因組的全部信息。為此它們必須解決端粒縮短所引起的不良后果，方法是在染色體末端補(bǔ)充新的端粒重復(fù)序列。端粒酶就是行使這種功能的DNA聚合酶，它是由RNA、蛋白質(zhì)構(gòu)成的核酸蛋白，可在體內(nèi)以酶結(jié)構(gòu)中的RNA成份（與端粒重復(fù)序列互補(bǔ)）為模板，在染色體末端催化添加TTAGGG重復(fù)序列。在生殖細(xì)胞中由于有端粒酶表達(dá)，其端粒不隨年齡增長(zhǎng)而縮短，故生殖細(xì)胞為永生細(xì)胞^[1]。
　　由于端粒縮短和端粒酶無(wú)活性，體細(xì)胞通常逐漸衰老死亡。僅有極少數(shù)細(xì)胞偶然通過(guò)激活端粒酶而逃避程序性老化，其生存延長(zhǎng)可能給另外的基因損傷的積累提供機(jī)會(huì)，導(dǎo)致進(jìn)行性腫瘤性發(fā)展^[2]。在大多數(shù)癌細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞中端粒酶均有高水平表達(dá)^[3]。表明端粒酶的激活表達(dá)與細(xì)胞的無(wú)限增殖有密切關(guān)系，通過(guò)解除細(xì)胞衰老過(guò)程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是體細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。
　　2 正常組織器官端粒酶表達(dá)
　　一些正常需要更新的組織表達(dá)低水平的端粒酶，其作用僅是部分補(bǔ)償末端復(fù)制問(wèn)題造成的端粒進(jìn)行性縮短^[1]。已發(fā)現(xiàn)有端粒酶表達(dá)的正常組織有外周血淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、胚胎體細(xì)胞、毛發(fā)、皮膚、子宮內(nèi)膜等分裂旺盛的組織。正常外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)端粒酶的水平僅為無(wú)限增殖的癌細(xì)胞的1%～2%^[4]。Hiyama等^[5]發(fā)現(xiàn)正常的腸道粘膜有端粒酶活性，他認(rèn)為這種酶表達(dá)起源于腸道基底干細(xì)胞，但其水平比癌性粘膜低10倍～100倍。盡管造血祖細(xì)胞和激活的淋巴細(xì)胞表達(dá)很強(qiáng)的端粒酶活性，但端粒仍然逐漸縮短，提示在這些細(xì)胞是以一種與端粒長(zhǎng)度無(wú)關(guān)的方式上調(diào)酶活性^[6]。
　　由于組織樣品通常是不同類(lèi)型細(xì)胞的混合物，其中可能含有表達(dá)端粒酶的正常細(xì)胞，如果不了解由正常細(xì)胞產(chǎn)生的背景表達(dá)水平，就有可能將正常細(xì)胞的表達(dá)誤判為腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。
　　3 端粒酶作為腫瘤標(biāo)志物早期診斷腫瘤
　　研究表明，大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞均有較高水平的端粒酶表達(dá)。而且在一些前侵襲性病變（如發(fā)育異常、原位癌）端粒酶表達(dá)的頻率很高^[2，3]，表明端粒酶激活是癌癥多步驟形成過(guò)程中的早期事件。常見(jiàn)惡性腫瘤端粒酶表達(dá)情形見(jiàn)附表。癌組織端粒酶表達(dá)有以下特點(diǎn)。
　　3.1 癌組織表達(dá)陽(yáng)性率很高，除少數(shù)腫瘤外，陽(yáng)性率均在80%以上。而癌旁組織和正常相應(yīng)組織陽(yáng)性率低于10%，為低水平表達(dá)。總體上，端粒酶表達(dá)與臨床特征無(wú)明顯關(guān)系，但與臨床病理學(xué)特征有一定。一些研究表明端粒酶活性反映了細(xì)胞的惡變程度。例如SCLC的惡性程度高于NSCLC，故端粒酶的檢出率和活性均高于NSCLC^[7]。胃癌中端粒酶陽(yáng)性腫瘤惡性程度較高^[8]。前列腺癌組織中端粒酶活性相對(duì)水平與病理分化有關(guān)，高水平端粒酶活性在分化差的前列腺癌中更常見(jiàn)^[9]。
　　3.3 在一些前侵襲性病變中端粒酶表達(dá)水平增加，如結(jié)腸腫瘤^[10]、口腔原位癌和發(fā)育異常病灶^[1]約半數(shù)表現(xiàn)端粒酶活性，盡管前侵襲病變并非都進(jìn)展為癌，但其中端粒酶表達(dá)陽(yáng)性者似乎可列為密切監(jiān)控的對(duì)象。
　　3.4 迄今為止的資料提示端粒酶可預(yù)測(cè)腦膜瘤、急性髓性白血病和胃腸道癌癥的預(yù)后。Langford等^[12]報(bào)道在端粒酶陽(yáng)性的普通腦膜瘤患者中端粒酶活性與預(yù)后顯著相關(guān)，這些形態(tài)學(xué)上良性的普通腦膜瘤中端粒酶的出現(xiàn)提示其中含有一群無(wú)限增殖細(xì)胞。在急性髓性白血病，端粒酶活性水平與特定的預(yù)后差的細(xì)胞遺傳學(xué)特征（11q異常、染色體5和7缺失）相關(guān)^[13]。
　　由于端粒酶在大部分惡性腫瘤檢出率很高，有可能用作癌癥篩查的標(biāo)志物。但是以侵入性方法獲取腫瘤組織樣品十分困難，非創(chuàng)傷性或微創(chuàng)傷性獲取樣品確定其端粒酶表達(dá)已受到積極關(guān)注。
　　kinoshita等^[14]比較了一組膀胱癌腫瘤樣品與隨意尿、膀胱沖洗脫落細(xì)胞的端粒酶表達(dá)。腫瘤組織樣品、膀胱沖洗液、隨意尿中端粒酶檢出率分別為98%（41/42）、84%（36/43）、55%（23/42）。而45例膀胱癌尿脫落細(xì)胞學(xué)僅42%檢出癌細(xì)胞。無(wú)癌者的膀胱沖洗液未檢出端粒酶。尿液和沖洗液脫落細(xì)胞端粒酶在I級(jí)癌檢出率為75%（9/12），II級(jí)為96%（27/28），而細(xì)胞學(xué)檢出癌細(xì)胞率I級(jí)為8%（1/12），II級(jí)為46%（13/28）。表明端粒酶檢測(cè)癌癥的敏感性顯著高于細(xì)胞學(xué)檢查，對(duì)膀胱癌的早期診斷和隨訪十分有用。
　　yoshita等^[5]對(duì)有或無(wú)結(jié)腸癌的住院患者的結(jié)腸沖洗物檢測(cè)端粒酶，其敏感性為60%（9/15），特異性為100%。在頭頸部癌患者的口腔沖洗物中，端粒酶陽(yáng)性率達(dá)32%（14/42），未發(fā)現(xiàn)口腔沖洗物陽(yáng)性而癌組織是陰性的現(xiàn)象^[11]。
　　作為微創(chuàng)傷性方法的細(xì)針穿刺在腫瘤的診斷取樣中被常規(guī)采用。Hiyama等^[16]在15例后來(lái)經(jīng)術(shù)后標(biāo)本組織病理學(xué)確診的乳腺癌的針吸標(biāo)本中全部檢出端粒酶表達(dá)。在有或無(wú)乳腺癌的患者中，細(xì)針抽吸樣品端粒酶檢測(cè)的診斷敏感性為67%，特異性90%^[17]。Nouso等^[18]用21G針活檢取肝癌患者肝組織，端粒酶陽(yáng)性率80%（8/10），與手術(shù)標(biāo)本的端粒酶陽(yáng)性率87%（20/23）無(wú)明顯差異。說(shuō)明細(xì)針活組織取樣檢測(cè)端粒酶可作為癌癥早期檢出的有力手段。
　　4 端粒酶測(cè)定方法
　　端粒酶由RNA和酶蛋白組成，其活性依賴(lài)于其RNA成分，用RNA酶處理后活性大部分喪失^[1]。目前檢測(cè)端粒酶表達(dá)有二種方法：一是以測(cè)其DNA聚合酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）；二是用RT-PCR測(cè)RNA組份。一些人認(rèn)為人端粒酶RNA組份可能比酶本身更與前侵襲性侵襲性腫瘤相關(guān)，但目前組織細(xì)胞端粒酶檢測(cè)仍是采用TRAP法為主。現(xiàn)將標(biāo)準(zhǔn)的TRAP分析步驟介紹如下^[3]：（1）用特殊緩沖液裂解待檢細(xì)胞制備出含端粒酶的抽提物；（2）用抽提物延伸引物TS（5’-AATCCGTCGAGC aGAGTT-3’）。由于端粒酶表現(xiàn)為步進(jìn)活性（progressive activity），每延伸一個(gè)TTAGGG序列便終止，進(jìn)入下一次延伸，因而產(chǎn)生了6bp差異的長(zhǎng)度異質(zhì)產(chǎn)物。（3）端粒酶反應(yīng)產(chǎn)物用引物CX（5’-CCCTTACCC tTACCCTTACCCTAA-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃30″、50℃30″、72℃45″，31個(gè)周期）。此步反應(yīng)摻入α-³²P dCTP以便顯示。（4）PCR產(chǎn)物用PAG分離，放射自顯影顯示。結(jié)果出現(xiàn)RNAse敏感的6bp梯子DNA帶為端粒酶陽(yáng)性。
　　附表 惡性腫瘤組織端粒酶活性

腫瘤部位或類(lèi)型	正常良性組織 　　癌旁組織	腫瘤組織（%）
頭頸扁平細(xì)胞癌	0/17正常組織	54/64（84.3）
肺 癌	3/68癌旁組織	109/136 （80.1）
肝 癌	4/46無(wú)癌肝組織	22/26 （85）
胃 癌	2/34癌旁組織	58/66 （85）
賁門(mén)食管癌	0/8正常組織	9/9
胰 腺 癌	0/11良性瘤組織	41/43 （95.3）
結(jié) 腸 癌	5/35對(duì)應(yīng)正常組織	22/23 （95.6）
腎 癌	0/10正常組織	40/56 （71）
前列腺癌	0/10正常和良性增生 　　1/10癌旁良性增生	28/31 （90）
膀 胱 癌	0/17非病灶	41/42 （98）
婦科惡性腫瘤		37/39 （95）
血液腫瘤		14/16 （87）
ALL		14/16 （87）
AML		41/56 （73）
皮 膚 癌	1/10正常皮膚	91
黑色素瘤	5/17良性黑痣	15/21 （71.4）

5 結(jié) 語(yǔ)
　　大量的研究已證實(shí)惡性腫瘤組織細(xì)胞中端粒酶活性增高與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，檢測(cè)端粒酶活性用于惡性腫瘤早期診斷顯示出誘人的前景。但有關(guān)端粒酶與腫瘤發(fā)生的過(guò)程有許多問(wèn)題尚待闡明，如端粒酶是怎樣激活的？同一種腫瘤為何有的表達(dá)有的則不表達(dá)端粒酶？無(wú)端粒酶表達(dá)的細(xì)胞是如何逃避衰老而成為無(wú)限增殖細(xì)胞？端粒酶、端粒酶RNA二者究竟誰(shuí)zui能真實(shí)反映端粒酶在腫瘤中的表達(dá)？端粒酶分析方法尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化等。
　　今后，應(yīng)在常見(jiàn)惡性腫瘤中進(jìn)一步研究何種腫瘤是端粒酶診斷應(yīng)用的*靶腫瘤，進(jìn)行檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，發(fā)展端粒酶定量檢測(cè)和原位檢測(cè)方法，研究端粒酶表達(dá)在癌癥監(jiān)測(cè)、療效和預(yù)后判斷中的作用。
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