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TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說明書

2012年06月29日 09:28:28人氣:1900來源:上海瑞齊生物科技有限公司

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【資料簡(jiǎn)介】

TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說明書(通用)
(BIOTIN標(biāo)記POD法,適用于細(xì)胞、組織樣本)
一 TUNEL檢測(cè)原理
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況,其原理是*(biotin)標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA的3‘-OH末端,并可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)特異結(jié)合,在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的存在下,產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)(呈深棕色),特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞,因而在普通顯微鏡下即可觀察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞;由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂,因而沒有3'-OH形成,很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟包埋、冰凍和超薄切片)和細(xì)胞樣本(細(xì)胞涂片)的凋亡原位檢測(cè)。
二 TUNEL試劑盒組分
組 份 20 assays 50 assays 100 assays 儲(chǔ)存條件
Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL 5.0 mL -20℃
Biotin-11-dUTP 20μL 50μL 100μL -20℃
TdT Enzyme 80μL 200μL 400μL -20℃
50×Proteinase K 40μL 100μL 200μL -20℃
Streptavidin-HRP 10μL 25μL 50μL 4℃避光
DAB 2mg  5mg  10 mg -20℃
TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說明書注意事項(xiàng)
1 使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀本說明書,提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。
2 因本試劑盒中組分均為微量,使用前請(qǐng)離心集液。
3 為避免試驗(yàn)誤差、降低試劑的損耗,建議使用精密度高的進(jìn)口微量移液槍及槍頭。
4 TdT 酶反應(yīng)液在使用前根椐樣本數(shù)量集中配制,再分別滴加于各樣本片上,避免每個(gè)樣本單獨(dú)配制而產(chǎn)生的試劑損耗。
5 另因DAB為固體粉末,使用前加入適量PBS溶解,配制成20×DAB(10 mg/ml)后,按下述方法顯色使用。
6 用戶自備:二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復(fù)染染液:蘇木素或甲基綠等、蓋玻片、載玻片、染色缸。
三 操作流程概覽
 
本試劑盒特點(diǎn)● 操作簡(jiǎn)便:使用Ready-to-Use型試劑,并配有Proteinase K 和DAB。
● 高靈敏度:可以單一檢出初期的凋亡細(xì)胞。
● 高特異性:能特異性染色凋亡細(xì)胞。
● 快速操作:整體操作約需3小時(shí)。
● 用途廣泛:可應(yīng)用于組織切片、細(xì)胞樣本等。
● 方便觀察:使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
● 高正確性:有陽(yáng)性對(duì)照片的制備方法,可以確認(rèn)試劑盒的有效性
四 檢測(cè)樣本的預(yù)處理
TUNEL檢測(cè)時(shí)樣本的預(yù)處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵所在,本說明書推薦的條件僅為普遍情況,用戶需根椐自已的樣本材料及試驗(yàn)結(jié)果來調(diào)整各個(gè)條件(參照Page 9),如處理時(shí)間、處理濃度等,來優(yōu)化出適合自身樣本的試驗(yàn)條件,從而做出客觀的試驗(yàn)結(jié)果。
1 細(xì)胞樣本的準(zhǔn)備.
 

TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說明書操作注意事項(xiàng):
1. 為防止樣本脫落,請(qǐng)使用硅烷(Silane)處理的載玻片或采用多聚賴氨酸鋪片。
2. 固定好的樣本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分鐘~一晚,以改善細(xì)胞的滲透性。
3. 使用PBS清洗細(xì)胞樣本時(shí),不要直接加在細(xì)胞樣本上,以防止細(xì)胞樣本的脫落。
4. 進(jìn)行PBS清洗時(shí),以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn)。
5. 固定液、PBS、封閉液、通透液、染色缸需用戶自備,請(qǐng)按上述方法配制。
2 石蠟組織切片的預(yù)處理
 

* 注意事項(xiàng):蛋白酶K處理的使用濃度、處理時(shí)間及溫度,都因組織的類型不同而有所不同,需要自已摸索優(yōu)化上述條件,如有問題,請(qǐng)根椐本說明書Page 9的《常見問題的原因及推薦解決方案》來調(diào)整條件。例如:如果凋亡細(xì)胞染色較弱時(shí),可用高濃度的Proteinase K(400μg/ml)處理5分鐘。(本試劑盒的50×Proteinase K濃度為1mg/ml)。
其它替代方法: 石蠟切片的預(yù)處理也可根椐實(shí)際情況可采用下述三種替代方法之一,即蛋白酶K處理的步聚改用下述方法,其余步聚均相同:
替代方法1: 將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min(通透液:0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉,需新鮮配制)
替代方法2: 將脫蠟及水合好的切片浸入*或*中8-10 min(*:0.25%-0.5%溶于HCl PH2,*0.25%-0.5%溶于0.01N HCl )
替代方法3: 將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的檸檬酸緩沖液PH 6 的塑料盒中,置于微波爐中350W(低檔)處理5 min。
3 冰凍切片的預(yù)處理
 
4 其它難于處理的組織切片的預(yù)處理
 
5 陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照的準(zhǔn)備
TUNEL檢測(cè)同時(shí)需要設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照,以顯示試驗(yàn)的客觀性及準(zhǔn)確性。因此需要按下述方法準(zhǔn)備兩個(gè)樣本來制備陽(yáng)性及陰性片,其后續(xù)步聚與待測(cè)樣本同樣進(jìn)行。
A:陽(yáng)性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備
組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后,細(xì)胞樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后,再加入100μL DNase I反應(yīng)液(10U-3000U DNase I,40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2)(用戶自備)室溫—37℃處理10 —30 min,其余步驟均相同。如有問題詳見Page 9.
B:陰性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備
在Page 8標(biāo)記反應(yīng)制備TdT酶反應(yīng)液時(shí),不添加TdT酶,其余步驟均相同。
五 標(biāo)記和顯色反應(yīng):
 
操作注意事項(xiàng):
1. 進(jìn)行PBS清洗時(shí),以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn)。
2. PBS清洗后,為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行,請(qǐng)盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)
3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后,請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜,或在濕盒中進(jìn)行,這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體,又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。
4. TdT酶反應(yīng)液即用即配,短暫于冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存,長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。
5. 如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色,則不可使用,需重新配制。
6. 用甲基綠(Methyl Green)染液(3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸* PH4.0)染色后,請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈(100%乙醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí),甲基綠比較容易脫色,注意快速進(jìn)行脫水操作。

上海瑞齊生物科技有限公司作者

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