ELISA法檢測白細胞介素-10

【資料簡介】

IL-10主要由Th2細胞產(chǎn)生，但Tho細胞、Th，細胞、CD8+T細胞、活化的B細胞、單核-巨噬細胞、kupffer細胞、肝細胞、角化細胞等也可產(chǎn)生。IL-10參與抑制細胞合成炎性因子、集落刺激因子（CSF）等主要負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，能廣譜抑制單核-巨噬細胞炎性介質(zhì)ILl、IL-6、IL-8、TFN-γ的合成及表達；在免疫反應(yīng)，可抑制Th：細胞產(chǎn)生細胞因子IL-2、IL-3、TFNγ等，其機制可能是通過與受體結(jié)合改變細胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)途徑而選擇性抑制有關(guān)細胞因子mRNA的合成，IL-10能抑制Th，細胞的增殖及分泌IL-2、TFN-γ等細胞因子，抑制Th：細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。正常肝內(nèi)存在的IL-10就可以通過上述機制或直接拮抗TNF等細胞因子的作用而抑制機體的抗病毒免疫，故有抗肝組織炎性損傷的作用。
[檢測方法] ELISA法
[方法學(xué)原理] 在微孔反應(yīng)板上包被抗人ILlo單克隆抗體，待測標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-10會與抗人IL-10單克隆抗體結(jié)合，游離的成分被洗去，同時加人*化的抗人IL10抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。*與親和素特異結(jié)合，抗人IL-10抗體與結(jié)合在單克隆抗體上的人IL-10結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有IL-10，HRP會使五色的顯色劑呈現(xiàn)藍色，加終止液變黃色。在波長450nm處測吸光度，IL-10濃度與吸光度成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中
的IL-10濃度。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈血2ml，不抗凝。
[試劑]
1．預(yù)包被微孔反應(yīng)板
2．濃縮酶結(jié)合物
3．酶結(jié)合物稀釋液
4．標(biāo)準(zhǔn)晶和標(biāo)本稀釋液
5．濃縮*化抗體
6．ILl0標(biāo)準(zhǔn)品
7．濃縮洗滌液
8．顯色劑A、B
9．終止液
[儀器] 酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀。
（檢測步驟）
1．在微孔反應(yīng)板相應(yīng)孔中分別加入待測樣本、不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul，再加*化抗體工作液50rd。
2．振蕩混勻，置20～25℃環(huán)境中溫育120min。
3．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。
4．除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液100ul。
5．振蕩混勻，置20-25C環(huán)境中溫育30min。
6．將孔內(nèi)液體吸干，用洗滌液充分洗滌5次，干燥。
7．每孔加入顯色劑A、B各50u1，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色10min。
8．加入終止液50ul后，輕輕振蕩混勻。用酶標(biāo)儀（450nm波長）測定各孔吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，求出IL-10水平。
[正常參考值] 各實驗室可根據(jù)檢測方法的不同確立正常參考值。
[注意事項]
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應(yīng)在室溫環(huán)境中平衡30min后方可使用，未用完的微孔條用自封袋密封保存。
2．酶標(biāo)板洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止孔內(nèi)有游離酶不能洗凈。應(yīng)設(shè)定30-60s的洗滌浸泡時間。
3．滴加試劑前應(yīng)將滴瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。滴加時瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。
4．所有樣品和廢棄物都應(yīng)按傳染源處理。終止液為2mol／L硫酸，使用時應(yīng)注意安全。
5．每批樣本應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6．檢測劑工作液按說明書臨用前配置。
7．若標(biāo)本吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍以外，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測。
[臨床意義] 在多發(fā)性硬化急性期IL-10水平處于低值，而緩解期水平則上升；SLE患者急性期IL-10 mRNA表達量明顯增高，緩解期水平則降低；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎患者急性期IL-10水平顯著升高，緩解期水平則降低。