動物細胞培養(yǎng)與觀察

【資料簡介】

細胞培養(yǎng)是將器官、組織或細胞從生物機體中取出，模擬該器官、組織或細胞在機體內(nèi)的生理條件，在體外進行培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生存、生長和繁殖。一些研究結(jié)果表明，許多種類的動物或植物的細胞都能在人工培養(yǎng)條件下生存、生長和繁殖。
現(xiàn)代的動物細胞培養(yǎng)始于美國動物學(xué)R.G.Harrison。他于1906年在無菌條件下，以淋巴液做培養(yǎng)基，培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)板，并觀察到神經(jīng)細胞突起生長的過程。到了20世紀后半葉，隨著分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)的崛起，為了在活細胞中研究生命現(xiàn)象，細胞培養(yǎng)方法得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。
細胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細胞生長、發(fā)育和分化等的影響。因為人工培養(yǎng)條件易于改變，并能得到嚴格的控制，有利于單因子分析。二是細胞培養(yǎng)便于我們對細胞生長、發(fā)育過程的觀察，可以用顯微鏡直接觀察亦可應(yīng)用顯微縮時電影技術(shù)記錄其進程。因而，細胞培養(yǎng)是探索和解釋細胞生命活動規(guī)律的一種簡而易行的技術(shù)。
然而，細胞培養(yǎng)方法也有其局限性，由于培養(yǎng)的細胞生活在脫離了機體的復(fù)雜的環(huán)境條件下，其生態(tài)環(huán)境和細胞之間的相互關(guān)系都改變了，因此，其細胞生物學(xué)性質(zhì)必然也會發(fā)生某些改變。所以在人工培養(yǎng)條件下觀察到的結(jié)果難于正確反映細胞或組織在機體內(nèi)部的狀況。這一點是我們在應(yīng)用此技術(shù)進行研究時應(yīng)該注意的。
盡管如此，由于細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是其他實驗方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來，細胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了很多重大的成果。
細胞培養(yǎng)是一種程序復(fù)雜而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞在體外長期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，共給細胞存活所必需的條件。如供給適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖以及有關(guān)的生長因子；氧氣及適宜的溫度；注意調(diào)節(jié)其外環(huán)境的酸堿度（pH）與滲透壓；以及為排除細胞代謝產(chǎn)物的危害，保持良好適宜的外環(huán)境而進行必需的傳代等等。所有這一切條件與操作都要保持在無菌條件下進行。

一、目的與要求
通過本實驗了解原代細胞與傳代細胞培養(yǎng)的基本方法以及在細胞培養(yǎng)過程中嚴格的操作程序。
初步掌握無菌操作的基本原則，認識無菌操作在細胞培養(yǎng)中的重要性。

二、實驗內(nèi)容
1、原代細胞的制作——示范
2、傳代細胞的傳代

三、實驗步驟
（一）原代細胞的制作——以乳鼠腎細胞原代單層靜置培養(yǎng)為例，按實驗時操作的順序進行描述。
1.操作者首*行手的清洗與消毒，再將實驗用品放在合適的位置，然后配置營養(yǎng)液及調(diào)節(jié)平衡鹽液的pH值。
2. 配液
（1）乳鼠腎細胞營養(yǎng)液的配置：
0．5％LH 液 90％
犢牛血清 10%
1萬單位/ml青、* 加至約100單位/ml
7.4%NaHCO3 調(diào)pH至6.8~7.0
（2）平衡鹽液－Hank液的調(diào)節(jié)：
用7.4％NaHCO3調(diào)Hank液的pH至6.8~7.0
（3） 調(diào)*的pH值
25%*溶液中加入數(shù)滴NaHCO3,充分混勻,使其pH值為6.8~7.0。
3 .處死動物
在動物細胞培養(yǎng)中，為避免過多血細胞的干擾，一般采用剪斷動物頸動脈放血的方法處死動物，然后用水浸濕體表的被毛（或用新潔爾滅溶液）。將動物固定在解剖板上，使其背部向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦過的部位。
4.取腎
在腰部的后緣，用解剖剪提起皮膚，剪開皮膚，將剪開的皮膚分別拉向兩邊。此時，再換一把解剖剪及解剖鑷，剪開背部的肌肉，暴露出腹腔，即可見到腎臟（一般右腎略低于左腎），用彎頭*取出腎臟，置于無菌培養(yǎng)皿中。
5.剪腎
用眼科剪及鑷，將腎膜剪破，并將其剝向腎門，去腎膜及脂肪。再用Hank液洗滌一次，再將洗過的腎臟轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中。另換一把眼科剪及鑷，沿腎臟的縱軸剪開，去掉腎盂部分，將腎剪成數(shù)塊，然后用Hank液洗滌一次。將洗過的腎塊轉(zhuǎn)移入無菌的*瓶（或小燒杯）中。用彎頭眼科剪，將腎剪成1立方毫米大小的塊，組織塊的大小應(yīng)盡量均勻一致，再用Hank液洗滌2～3次，直到液體澄清為止。
6.消化及分散組織塊
將上步清洗過的Hank液吸掉，按組織塊體積的5～6倍量加入0.25%*液（pH為7.6~7.8）。置于37℃水浴中進行消化。消化時間在20～40分鐘左右（消化時間的長短與多種因素有關(guān)，如蛋白酶的活性及濃度，不同動物及年齡，組織塊的大小等等）。每隔10分鐘搖動一次*瓶，以便組織塊散開，以利于繼續(xù)消化，直到組織變成松散、粘稠狀，并且顏色略變?yōu)榘咨珵橹埂＿@時可從水浴中取出*瓶，吸去*液，再用 Hank洗滌2～3次。然后，加入少量乳漢液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，直到大部組織塊均勻分散成混淆的細胞懸液為止。此時，可將分散的細胞懸液經(jīng)過滅菌的紗布（或不銹鋼網(wǎng)）進行過濾，以除去部分較大的組織碎片。