實驗技術(shù)：細胞培養(yǎng)基本技術(shù)

【資料簡介】

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一、操作規(guī)程：

1.實驗前,無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射30-60分鐘滅菌,用70％酒精擦拭無菌操作臺面,并開啟無菌操作臺風機運轉(zhuǎn)10分鐘后,才可開始實驗操作.每次操作只處理一株細胞,以免造成細胞交叉污染.實驗結(jié)束后,將實驗物品帶出工作臺。如需要繼續(xù)進行下一個實驗,則用70％酒精擦拭無菌操作臺面,再讓無菌操作臺風機運轉(zhuǎn)10分鐘后,才可進行下一個實驗操作。

2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞,必要物品,如試管架,移液器或吸管頭等可以暫時放置,其它實驗用品用完后應(yīng)及時移出,以利氣體流通.實驗用品要用70％酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在操作臺*無菌區(qū)域內(nèi)進行,勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。

3.小心取出無菌實驗用品,避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口,不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,用手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。

4.工作人員應(yīng)注意自身的安全,必須穿戴實驗衣與手套后才進行實驗。對于來自人源性或病毒感染的細胞株應(yīng)特別小心,并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺（至少兩級）。操作過程中,應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,小心有毒性試劑,例如DMSO及TPA等,并避免尖銳物品傷人等。

5.定期檢查下列項目：CO2鋼瓶內(nèi)的CO2壓力；CO2培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2濃度,溫度,及水盤是否有污染；無菌操作臺內(nèi)氣流壓力是否正常,定期更換紫外燈管及HEPA過濾器濾膜,預(yù)濾網(wǎng)（300小時/預(yù)濾網(wǎng),3000小/HEPA）。

二、粉末細胞培養(yǎng)基的配制（以1 升為例）：

細胞培養(yǎng)基通常須添加10％血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為 7.2 - 7.4。NaHCO3另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成 pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。

【試劑與設(shè)備】

1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要）

2. 粉末培養(yǎng)基 （1640、DMEM等）

3. NaHCO3 （Sigma S-4019）

4. 電磁攪拌器

5. 無菌血清瓶

6. 0.22 微米無菌過濾膜

7. pH meter

8. 真空瓣

9. CO2 氣體

【配制步驟】

1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。

2. 稱取適量之NaHCO3粉末（數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異）溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3-5 分鐘。

3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫助通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。

4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃ （血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾）。

5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。

【注意事項】

1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 ℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。

2. 液體培養(yǎng)基（加血清） 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。