簡并引物設計的方法(包括實際操作步驟)簡并引物是指用來編碼一段短肽序列的不同堿基序列的混合物。主要用來同源克隆未知的基因，或用來分析某一種基因多態性的一種方法。

簡并引物設計的常見程序如下：

1. 利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列。

因為密碼子的關系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統，查找到一條相關序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白)，在整個Nr數據庫中中查找與之相似的氨基酸序列。

2. 對所找到的序列進行多序列比對。

將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，采用局部比對程序如BLOCK，也可選工具Clustal W，也可在線分析www.ebi.ac.uk/clustalw. 其結果如下圖所示，所有序列的共有部分將會顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。

3. 確定合適的保守區域。

設計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區域，且兩個保守區域相距50~400個氨基酸為宜，使得pcr產物在150~1200bp之間，zui重要的是每一個保守區域至少有6個氨基酸，因為每條引物至少18bp左右。

若比對結果保守性不是很強很可能找不到6個氨基酸的保守區域，這時可以根據物種的親緣關系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對。總之，究竟要選多少序列來比對，要根據前一次比對的結果反復調整。zui終目的就是至少有兩個6個氨基酸且兩者間距離合適的保守區域。

4. 利用軟件設計引物。

當得到保守區域后，就可以利用專業的軟件來設計引物了，如利用pp5進行簡并引物的設計。將參與多序列比對的序列中的任一條導入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結果是有n多條彼此只相差一個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T，N=A/C/G/T)，該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區域的對應部分，在pp5中修改參數，令其在兩個距離合適的保守的nt區域內尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區域內，結果會有數對，分數越高越好。

使用專門的簡并引物設計方法如：CODEHOP bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html

GeneFisher2 bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/

在這里我們特別值得說明的是CODEHOP方法，該方法要求的保守區較短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一種非常有效的方法。該方法主要是通過將簡并區放在3′末端，并在5′端設計一個一致性的區域來降低兼并度。

5. 對引物的修飾

若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，則其簡并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡并度太高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N(因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對)和根據物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度。

注意：該方法設計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。

引物中符號說明：

A代表A

C 代表C

G代表 G

T 代表T

M 代表A or C

R 代表A or G

W代表 A or T

S代表 C or G

Y代表 C or T

K代表 G or T

V 代表A or C or G

H 代表A or C or T

D代表 A or G or T

B 代表C or G or T

N代表 G or A or T or C

由于引物的簡并性的問題，所設計的引物通常簡并性過高，導致有效引物利用率降低，PCR產物非特異性增高。

雖然減少簡并引物長度可以相對減少簡并性，但隨之而來的問題是引物的Tm值過低，有時不得不設計第二對引物對PCR產物進行二次擴增，即巢式PCR，或者需要與Touchdown PCR相結合使用。

與通常設計的簡并引物不同，利用CodeHop方法設計簡并引物。引物由兩部分組成：引物3’端為根據4-5個保守氨基酸設計的核心簡并區(3’core region)，長度只有11-15個堿基;引物5’端為非簡并性夾板結構(5’consensus clamp region)。5’端夾板結構是根據密碼子偏向性設計的一致性序列，它zui大程度的預測了保守性氨基酸的編碼序列，其長度取決于所需的退火溫度。這樣設計的優點在于既減少了引物的簡并度，又提高了引物的退火溫度，保障了PCR產物的特異性。標準簡并PCR在聚合反應的晚期，隨著產物的增多，引物的非特異性結合的現象增多;而CodeHop PCR的晚期，這種現象大為減少。實驗結果表明，按這種方法設計的簡并引物非特異性擴增減少，是一種快捷方便的簡并引物設計方案。