磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶1抗體

1．        WB對照系統
陽性對照：有標準品，或陽性血清、陽性上清。
陰性對照：測血時用相應小鼠未免疫血清，測培養上清，用無克隆培養上清。
空白對照：不加一抗，用1%BSA代替。
無關對照（替代對照）：用無關項目一抗，或無關項目的抗體。
2.切割膜時，大小一般為3-5mm,一抗的體積為每條膜保證1ml。
3.KSHV、MCMV、HCMV項目測血時，血清稀釋度為1:500-1:1000。
4. KSHV、MCMV、HCMV項目WB鑒定時，一抗如為IgG型,二抗采用AP-Anti mouse IgG（Whole molecule）,SIGMA,CAT#A-3562; 一抗如為IgM型，二抗采用AP-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT#62-6422。
5.多肽項目WB鑒定，二抗全部采用AP-Anti mouse IgG（Whole molecule）,SIGMA,CAT#A-3562。

Preparation of cell lysates 

Collect cells （confluent T-25） by trypsinization and spin. 
Lyse the pellet with 100 µl lysis buffer on ice for 10 min. 
For 500,000 cells, lyse with 20 µl. 
Spin at 14,000 rpm （16,000 g） in an Eppendorf microfuge for 10 min at 4°C. 
Transfer the supernatant to a new tube and discard the pellet. 
Determine the protein concentration （Bradford assay, A280, or BCA） 
（We use the Bradford assay from Bio-Rad.） 
Take x µl （= y µg protein） and mix with x µl of 2x sample buffer. 
Boil for 5 min. 
Cool at RT for 5 min. 
Flash spin to bring down condensation prior to loading gel. 

B. Polyacrylamide gel （14.5 cm x 16.5 cm） 

Agarose plug:  磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶1抗體Anti-phospho-MEK1/MAPKK1（pSer298）
1% agarose dissolved in 1x Resolving gel buffer. 
（I make 50 ml, keep melting it as I need it, and re-adding water to maintain agarose conc.） 
Resolving gel: 24 ml of a 9% gel 
5.4 ml 40% acrylamide/bisacrylamide （29:1 mix） 
3 ml 8x Resolving gel buffer 
15.6 ml water 
12 µl TEMED 
60 µl 20% ammonium persulfate 
Stacking gel: 8 ml 
1 ml 40% acrylamide/bisacrylamide （29:1 mix） 
2 ml 4x Stacking gel buffer 
5 ml water 
8 µl TEMED 
21.6 µl 20% ammonium persulfate 

C. Preparation of gel 

Assemble the glass plates and spacers （1.5 mm thick）.