熒光素標記血管粘附蛋白1抗體IgG，Anti-VAP1/FITC

蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。（二）電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。

轉移：（半干式轉移）
1、電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉膜緩沖液平衡，5min×3次。
2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩沖液中10min。
3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓 500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。

免疫反應：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。
3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。
5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩搖動，室溫2hr。
7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。
四、注意事項
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定*條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細