辣根過氧化物酶標記兔抗季節性A型人流感病毒H1N1抗體IgG（美國加州型）

Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質通過疏水作用產生不可逆的結合。但是這種方法轉移效率低，通常只能轉移凝膠中的一小部分蛋白質（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進行轉移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質在電場力的作用下離開凝膠結合到NC膜上。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理*相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。濕轉是一種傳統方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。
轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，而其它的蛋白質不能與一抗結合，這樣清洗除去未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。目前有結合各種標記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，zui常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當的底物溶液處理，當酶催化底物生成有顏色的產物時，就會產生可見的區帶，指示所要研究的蛋白質位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉化為藍色的產物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產物或將4-氯萘酚氧化成藍色產物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾并發光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標蛋白質的存在了。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗（可通過紫外燈產生熒光）；*結合的二抗等等。
除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結合蛋白。
在Western bloting實驗中，有另一種方法，就是直接標記一抗，再用底物顯色。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標記二抗可用于很多種不同特異性的一抗，避免了標記很多一抗的需要，同時因為一抗結合不止一個二抗分子，所以二抗可以增強信號。所以一般情況下都釆用間接法進行檢測。