熒光素標記血管內皮生長因子A抗體IgG相關知識

加一抗與抗原結合
①將加樣槽洗滌干凈，將膜用一次性手套覆蓋好，按標記和實驗設計切下膜條并作好記號，按順序置于加樣槽中加入相應的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②室溫下于搖床孵育2h或4℃過夜。
③棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽中的膜用PBST在搖床洗滌洗滌5min左右 ，換液，反復4-5次。

加二抗與一抗的結合
① 根據實驗需要和設計選擇合適的酶標二抗和稀釋濃度（PBS稀釋），每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加PBST在搖床洗滌洗滌5min左右，換液反復4-5次。

顯色反應（重組蛋白一般用AP顯色或是DAB顯色，裂解液一般用發光法）
① HRP標記二抗用DAB顯色，按順序依次將DAB三種劑各取3滴于5ml蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色5-15min終止反應，對照Marker記錄實驗結果，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標記二抗用AP顯色，在10mlAKP緩沖液中加入66µlNBT溶液和33µl BCIP溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（37℃可加速反應）5-15min。對照Marker記錄實驗結果，將NC膜晾干掃描保存。
③底物發光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時間根據光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時間后會越來越弱要控制好時間）