小鼠巨噬細胞冷凍細胞活化

1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死 亡。

2. 細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常（例如產生單株抗體或是其它蛋白質）。

3. 材料

3.1 37 oC 恒溫水槽

3.2 新鮮培養基

3.3 無菌吸管/ 離心管/ 培養瓶

3.4 液氮或干冰容器

4. 步驟：

4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時 蓋子易松掉。

4.3 將新鮮培養基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。

4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。

4.5 取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內（稀釋比例為 1:10～1:15），混合均勻，放入CO2 培養箱培養。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。

4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO 或glycerol），依細胞種類而異， 一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養基之離心管內，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2 培養箱培養。

4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。

細胞傳代培養

1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。

2. 材料：

2.1. 無菌磷酸生理緩沖液（Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010）

2.2. trypsin-EDTA solution （0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062）： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽回溫。

2.3. 新鮮培養基

2.4. 無菌吸管/離心管/培養瓶

3. 步驟：

3.1. 附著型胞（adherent cell）

3.1.1. 吸掉舊培養液。

3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液（1ml/25cm2, 2ml/75cm2），37 oC 作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。（若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清 之新鮮培養基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。）

3.1.4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

3.2. 懸浮型細胞（suspension cell）

3.2.1. 吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。

3.3. 融合瘤（hybridoma）

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養瓶中。