ELISA技術(shù)測定

一、儀器、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。

原料

單克隆抗體

試劑

1. 抗原及酶標(biāo)記抗體

①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG，Code No.A0423);

②酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No.P0260);均為

DAKO 公司產(chǎn)品，使用時(shí)按照說明書要求稀釋。

4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL。

5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20。

6. 底物溶液

①*緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。

② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。

③底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL，混勻。

7. 終止液：2mol/LH2SO4

二、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板

中。4℃放置過夜。

②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h。

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每個(gè)樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，已知樣品作為陽性對(duì)照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍(lán)色。

⑩終止反應(yīng)、比色：加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標(biāo)儀測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測樣品的效價(jià)。