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細胞計數與存活測試

2025-4-27  閱讀(30)

  細胞計數與存活測試:
 
  1、原理:
 
  (1)計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。
 
  (2)血球計數盤一般有二個chambers,每個chamber中細刻9個1mm2大正方形,其中4個角落之正方形再細刻16個小格,深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時,計數每個大正方形內之細胞數目,乘以稀釋倍數,再乘以104,即為每ml中之細胞數目。
 
  (3)存活測試之步驟為dyeexclusion,利用染料會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料,如果細胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率:活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。計數應在臺盼蘭染色后數分鐘內完成,隨時間延長,部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質有很強的親和力,用不含血清的稀釋液,可以使染色計數更為準確。
 
  2、材料:
 
  0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
 
  3、步驟:
 
  (1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
 
  (2)取少許混合液(約15μl)自血球計數盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。
 
  (3)計數四個大方格之細胞總數,再除4,乘以稀釋倍數(至少乘以2,因與trypanblue等體積混合),最后乘以104,即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上,只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
 
  注:4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
 
  計數板計數時,最適濃度為5~10×105細胞/ml,此范圍外計數誤差偏大。高濃度細胞懸液,可取出部分作稀釋或連續稀釋后計數。
 
  5、范例:
 
  T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液,取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計數盤,計數四大方格內之細胞數目。
 
  活細胞數/方格:55,62,49,59;死細胞數/方格:5,3,4,6;細胞總數=243
 
  平均細胞數/方格=60.75;稀釋倍數=2;
 
  細胞數/ml:60.75×104×2(稀釋倍數)=1.22×106;
 
  細胞數/flask(10ml):1.22×106×10ml=12.2×106
 
  存活率:225/243
 


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