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上海鈺博生物科技有限公司
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閱讀：450發(fā)布時間：2017-7-27
二聚體蛋白熒光標(biāo)記應(yīng)用單分子FRET研究獲進(jìn)展
英國*化學(xué)會主辦刊物Chemical Communications（ChemComm）以封面論文（Inside Front Cover）的形式在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物物理研究所柯莎（Sarah Perrett）研究組題為A Co-expression Strategy to Achieve Labeling of Individual Subunits within a Dimeric Protein for Single Molecule Analysis的文章，論文報道了一種基于共表達(dá)的方式獲得異二聚體蛋白，以實現(xiàn)對二體蛋白中某一單體上進(jìn)行位點特異性熒光標(biāo)記的方法，該方法可應(yīng)用于二聚體蛋白構(gòu)象及動力學(xué)機(jī)制的單分子FRET研究。
單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）是研究生物大分子的構(gòu)象及動力學(xué)機(jī)制的重要方法，尤其對于結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段不易解析的無序蛋白（intrinsically disordered protein），單分子FRET技術(shù)可通過測量標(biāo)記的熒光供體與受體染料對之間的距離，分析無序蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象信息。單分子FRET研究首先需要在目標(biāo)蛋白特定位點標(biāo)記熒光分子，目前廣泛使用的標(biāo)記方法是引入半胱氨酸殘基定點突變再與馬來酰亞胺官能化染料進(jìn)行共價反應(yīng)。上述方法僅適用于單體蛋白，而生物體中許多蛋白質(zhì)均以二聚或寡聚狀態(tài)存在及行使功能，對于這些蛋白難以通過傳統(tǒng)的半胱氨酸標(biāo)記方法對其進(jìn)行單一FRET染料對的位點特異性標(biāo)記。在以往的研究中，對于二聚體蛋白多采用亞基交換獲得異二聚體，或截斷二聚體作用界面的結(jié)構(gòu)域使之形成單體再進(jìn)行單分子FRET實驗，但這些方法有明顯的局限性。
本研究提出了一個共表達(dá)的策略，即利用pQLink載體同時表達(dá)野生型及突變型的蛋白，獲得由一個無標(biāo)記單體與一個特異性標(biāo)記FRET染料對的單體組成的異二聚體。文章以釀酒酵母prion蛋白Ure2（其天然態(tài)以穩(wěn)定二聚體形式存在）為例，基于上述標(biāo)記策略將FRET染料對分別標(biāo)記于Ure2 N端prion無序結(jié)構(gòu)域以及C端球形功能結(jié)構(gòu)域，采用單分子FRET技術(shù)確定了N端結(jié)構(gòu)域相對于C端結(jié)構(gòu)域的空間位置及其發(fā)生相互作用的區(qū)域。這種新的標(biāo)記方法克服了經(jīng)典的半胱氨酸標(biāo)記二聚體蛋白質(zhì)的局限性，且具有普適性，使單分子FRET技術(shù)可擴(kuò)展研究具有重要生物學(xué)功能的二聚體蛋白。
生物物理所研究員柯莎和副研究員吳思為本文的共同通訊作者，柯莎課題組的博士生婁飛為本文的*作者，博士生楊潔為參與者。該研究得到了科技部973計劃、自然科學(xué)基金委項目等的資助。
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