NK細胞的制備方法，即通過聯(lián)合細胞因子和飼養(yǎng)細胞的刺激作用，提高NK細胞的增殖速度和純度。本發(fā)明的主要特點是：NCR3LG1和m?IL-15同時轉染到K562細胞，m?IL-15可以調節(jié)NK細胞的活化和增殖，而NCR3LG1作為NK細胞表面主要的活化受體之一NKp30的配體，可以有效的刺激NK細胞活化，且兩者有協(xié)同作用。本發(fā)明提供出一種聯(lián)合飼養(yǎng)細胞和游離因子共同培養(yǎng)制備NK細胞的方法。

1.NK 細胞的制備：懸浮NK 于接種培養(yǎng)液中，細胞濃度調至106/ml。

2.培養(yǎng)基接種NK 細胞

　1）于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細胞12min。

　2）被離心的飼養(yǎng)細胞懸浮于飼養(yǎng)培養(yǎng)液中，細胞濃度調至2×106/ml。

　3）用強度5000radγ射線照射飼養(yǎng)細胞，于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細胞12min，將離心細胞再懸浮于飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中，飼養(yǎng)細胞濃度調至2×106/ml。

　4）在6 塊96 孔培養(yǎng)板的各孔中加100μl 上述飼養(yǎng)細胞懸液（總量用60ml 飼養(yǎng)細胞懸液，含1．2×108 個飼養(yǎng)細胞）。

　5）將96 孔板置37℃孵箱預溫，直到加入NK 細胞。

　6）將NK 細胞懸浮于接種培養(yǎng)基液中，并于預溫的96 孔板中加入100μlNK 細胞，使成為10 細胞/孔、5 細胞/孔和2．5 細胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復二塊板。

　7）將培養(yǎng)板置5％CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)。

3.NK 細胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養(yǎng)細胞）

　1）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。

　2）每孔中加入含有經照射的飼養(yǎng)細胞（2×106 細胞/ml）的NK 克隆培養(yǎng)液100。此培養(yǎng)液的制備方法如下：

　（1）融化飼養(yǎng)細胞，移至50ml 試管中。

　（2）輕輕地加入培養(yǎng)液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養(yǎng)細胞。

　（3）用300×g 離心飼養(yǎng)細胞12min，并計數飼養(yǎng)細胞數量。

　（4）按細胞計數結果，將飼養(yǎng)細胞懸浮于NK 克隆培養(yǎng)液中，調至細胞濃度為2×106/ml。

4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆培養(yǎng)液100μl。

5.檢測NK 細胞的生長狀況（9－10 天）如檢查有細胞生長，按第8 天的操作換液。

6.分離克隆（11－15 天）

　1）當培養(yǎng)基液顏色變黃時，證明細胞已生長，在96 孔板上將生長的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆培養(yǎng)。

　2）在96 孔板上擴增克隆，并重復第7 天的操作。