一、原理

    活細胞的胞漿內含有LDH。正常情況下，LDH不能透過細胞膜，當細胞受到NK細胞的殺傷后，LDH釋放到細胞外。LDH 可使乳酸鋰脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT 接受H＋被還原成紫紅色甲月贊類化合物。在酶標儀上用490nm比色測定。

二、儀器和材料

    酶標儀、YAC-1細胞、Hank's液（pH7.2～7.4）、RPMI1640*培養液、乳酸鋰或乳酸鈉、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.2）、1%NP40或2.5%Triton

三、實驗步驟

1、LDH基質液的配制

乳酸鋰5×10-2mol/L

硝基氯化四氮唑（INT） 6.6×10-4mol/L

吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS） 2.8×10-4mol/L

氧化型輔酶Ⅰ（NAD） 1.3×10-3mol/L

將上述試劑溶于0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液中（pH8.2）

2、靶細胞的傳代（YAC-1細胞）

實驗前24h將靶細胞進行傳代培養。應用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640*培養液調整細胞濃度為4×105個 /mL。

3、脾細胞懸液的制備（效應細胞）

    無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細胞懸液。經200目篩網過濾，或用4層紗布將脾磨碎，或用 Hank's液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。棄上清將細胞漿彈起，加入0.5mL滅菌水20秒，裂解紅細胞后再加入0.5mL2倍 Hank’s液及8mLHank’s液，1000rpm，10min離心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640*培養液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數（活細胞數應在95%以上），用臺酚蘭染色計數活細胞數（應在95%以上），zui后用RPMI1640*培養液調整細胞濃度為2×107個 /mL。

4、NK細胞活性檢測

    取靶細胞和效應細胞各100μL（效靶比50：1），加入U型96孔培養板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100μL，靶細胞zui大釋放孔加靶細胞和1％NP40或2.5%Triton各100μL；上述各項均設三個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養4h，然后將 96孔培養板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養板中，同時加入LDH基質液100μL，反應3min，每孔加入 1mol/L的HCl30μL，在酶標儀490nm處測定光密度值（OD）。

按下式計算NK細胞活性，受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，即可判定該項實驗結果陽性。

反應孔OD－自然釋放孔OD

NK細胞活性（%）＝ ────────────────── ×100%

zui大釋放孔OD－自然釋放孔OD

四、數據處理及結果判定

    NK細胞活性需進行數據轉換，X＝Sin-1 ，式中P為NK細胞活性，用小數表示，然后再進行方差分析，在進行方差分析時，需按方差分析的程序*行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值< F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

五、注意事項

1、靶細胞和效應細胞必須新鮮，細胞存活率應大于95％。

2、比色時環境溫度應保持恒定。

3、LDH基質液應臨用前配制。

4、在一定范圍內，NK細胞活性與效靶比值成正比。一般效靶比值不應超過100。