PCR需要注意的一些問題
擴增長目的片段當擴增大于5kb的目的片段時，可以使用用于超長PCR的酶或酶混合物以獲得*產量）。Taq DNA聚合酶并不能有效擴增較長目的片段（大于5kb），可能是因為其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能糾正dNTP錯誤摻入。錯誤配對的延伸幾率大大降低，減少了較長產物的產量。將Taq DNA聚合酶同帶有3'-5'外切核酸酶活性的熱穩定DNA聚合酶混合，可以擴增zui高為30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（帶有3'-5'外切核酸酶活性）也可以擴增較長產物（≤12kb）。除了選用正確的熱穩定DNA聚合酶，較長產物的擴增還需要改變標準步驟的延伸時間、變性時間、緩沖液pH。按1分鐘/kb增加延伸時間使聚合酶完成合成。一般對于有效的超長PCR，延伸溫度會低至68℃。因為延伸時間較長，對于20kb的模板高達20分鐘，所有使用較高起始pH的緩沖液。如果pH將至低于pH7.0，DNA會脫嘌呤。為了防止模板損傷，在每個循環將94℃變性時間減少到30秒或更短，將在擴增前溫度增加到94℃變性溫度的時間限制為小于等于1分鐘。引物使用標準方法所使用的同樣的方法設計，使用18到24個堿基得到較好的產量。防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產物用來進行新的擴增反應時，會發生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源。可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用抗氣霧劑移液管的阻止氣霧劑進入eppendorf管內。為PCR樣品配制和擴增后分析設計隔離的區域，在準備新反應前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。使用預先混合的反應成分，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。一種防止殘余污染的方法是使用*DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為*-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的*。在擴增過程中將脫氧*替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產物同模板DNA區分開來。因為前面的擴增產物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應用UDG處理以破壞殘余產物。PCR產物純化殘余反應成分包括抑制克隆，測序和標記反應的引物，核苷和熱穩定聚合酶。因此，一般在進一步操作之前需要純化PCR產物。包括多次酚：氯仿抽提及隨后的PEG沉淀或異丙醇沉淀的純化步驟雖然有效，但是耗費時間，且會丟失產物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分鐘內從反應成分中純化PCR產物。它對80bp到10kb很大范圍的PCR片段都有效，有效回收95％的原有樣品（圖26）。擴增后PCR片段的純化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含約1μg擴增產物的完整PCR體系。引物36到40堿基長。將峰值反應純化，對純化前（泳道A）和純化后（泳道B）的洗脫液水相使用瓊脂糖凝膠電泳分析。部分PCR產物可能需要通過凝膠電泳，和影響克隆和測序的非特異性PCR產物分離純化出來。使用Maligen Gel Extraction System將目的產物從瓊脂糖中純化出來，這是一種基于硅土的，從凝膠中快速純化DNA片段的技術。