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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：766發布時間：2011-9-16
原理】
Western印跡法，把聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的組分從凝膠轉移至一種固定支持體，以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。對于蛋白質來說，通常使用的探針是抗體，它與附著于支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。
【試劑與器材】
1.細胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0
2.2×上樣buffer：100mmol/LTris-HCl,pH6.8，200mmol/LDTT,4%SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油
3.分離膠：水，30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/LTris（pH8.8），10%SDS，10%過硫酸銨，TEMED
4.濃縮膠：水，30%丙烯酰胺溶液，1.0mol/LTris（pH8.8），10%SDS，10%過硫酸銨，TEMED
5.1×電泳buffer：25mmol/LTris-Hcl,pH8.0,250mmol/L*,0.1%SDS,pH8.3
6.電轉移buffer：39mmol/L*,48mmol/LTris-Hcl,0.037%SDS,20%甲醇
7.封閉液：5%脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，0.02%Tween-20溶于PBS
8.漂洗液Ⅰ（0.01mol/LPBS，pH7.2）
9.漂洗液Ⅱ（150mmol/LNaCl,50mmol/LTris-Cl,pH7.5）
10.二抗稀釋液（5%脫脂奶粉，0.02%Tween-20，150mmol/LNaCl,50mmol/LTris-Cl,pH7.5）
11.ECL顯色液：試劑盒
12.微型垂直板電泳槽
【操作步驟】
（1）樣品制備
將細胞以4.0×108/L密度接種于用12孔培養板中，每孔3mL，37℃、5%CO2孵箱中培養至細胞貼壁，加入長春新堿，使之終濃度分別為0、10、100μg/mL。繼續培養過夜。棄去培養基，以冷PBS（pH7.2）洗滌細胞，每孔加入100μL細胞裂解液,用細胞刮刮下細胞，-20℃放置20min,將裂解液收集于1.5mL的EP管中，冰上超聲破碎細胞（10s/次×3次，間隔15s），4℃，12000×g離心5min，收集上清液，蛋白質樣品與等體積2×上樣buffer混勻，煮沸5min，紫外分光光度法測定蛋白質濃度（A215/A225）。立即上樣或將樣品保存于-20℃備用。
（2）SDS-PAGE
采用微型垂直板電泳槽制備0.75mm厚的凝膠。首先制備10mL12.5%分離膠，混勻后立即灌膠，小心加蒸餾水覆蓋，室溫聚合30min，膠聚合后，傾去蒸餾水。制備5mL5%成層膠，插入樣品梳，避免產生氣泡，室溫聚合40min，小心取出樣品梳，用蒸餾水小心沖洗加樣孔數遍后，將凝膠板裝到電泳槽上，加入1×電泳buffer。上樣50μg/孔。恒壓200V電泳約45min，當溴酚藍到達分離膠底部時，關閉電源，小心剝離凝膠。
（3）用考馬斯亮藍R-250對凝膠染色及脫色
（4）轉膜
按照凝膠>NC膜>濾紙的順序，剪好一張NC膜（標記一角）和6張新華濾紙，將NC膜在蒸餾水中浸泡5min以消除氣泡，同時用電轉移buffer浸泡濾紙、凝膠、吸水海棉層。按說明書裝好電轉移槽，將黑色多孔塑料夾放在zui底層，再依次放置吸水海棉層、3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙、海棉層、無色多孔塑料夾，注意趕氣泡，合攏好夾子放入電轉移槽中（黑的靠黑的，白的靠紅的），正確連接電極，即膠朝陰極，NC膜靠陽極，使凝膠上的蛋白質向NC膜印跡轉移。100V恒壓，加冰條件下電轉移3h。起始電流應小于250mA，結束電流不應超過400mA。
（5）免疫印跡
從電泳槽上取出NC膜，用PBS洗2次，以除去NC膜上的凝膠。裝NC膜于一可加熱封接的塑料袋中，加入封閉液（5%脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，0.02%Tween-20溶于PBS），放在平緩搖動的搖床封閉3h。封閉結束，將膜轉移至新的可加熱封接的塑料袋中，按0.1mL/cm2的量加入封閉液和適量的*抗體（兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體1∶200），封口，4℃振搖過夜。剪開塑料袋，用約200mL漂洗液Ⅰ洗3次，各10min，以除去過量的一抗。用漂洗液Ⅱ洗3次，每次10min，除去NC膜上的磷酸鹽及疊氮鈉。將膜轉入另一塑料袋，加入溶于二抗稀釋液的二抗（1∶5000），封口，室溫平緩搖動1h。取出NC膜，用大量漂洗液Ⅱ洗5次，各10min，以除去未結合的二抗。將ECL顯色液Ａ與Ｂ臨用前等量混合，浸泡膜1min，暗室X-ray膠片曝光，顯影、定影，翻拍成照片，*保存或成像系統成像保存。
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