科研實驗都離不開細胞的培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)的好壞關(guān)乎實驗的zui終結(jié)果，下面我們整理了一些難養(yǎng)的細胞培養(yǎng)方法.

1）球體細胞培養(yǎng)：

1. 瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶：30ml無菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5ml 2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用。 
2.取生長狀態(tài)良好已連接成片的細胞，用彎頭吸管伸入瓶內(nèi)，把細胞縱橫割劃成若干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液。 
3.加入0.25%的*液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當(dāng)細胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養(yǎng)液3~5 ml，用吸管把已松動的細胞片吸打下來，分裝入1~3個含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長成細胞球體。 
4.換液：培養(yǎng)1~2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細胞下沉后，吸除部分培養(yǎng)液，再補充新培養(yǎng)液。 

小鼠胚胎成纖維細胞（cat.No.M7540）

2）胚胎成纖維細胞培養(yǎng)

用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用*消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒bao皮是培養(yǎng)成纖維細胞的很好對象。 

大鼠巨噬細胞（Cat.No.R1920）

3）巨噬細胞培養(yǎng)

1．實驗前三天，向每只大鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內(nèi)）。

2．引頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

3．置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動。

5．用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)。

6．小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養(yǎng)基。

7．計數(shù)細胞，每只小鼠可產(chǎn)生20～30×105細胞，其中90％為巨噬細胞。

8．為獲取3×105個帖附細胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。

9．為純化培養(yǎng)細胞，去除其它白細胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養(yǎng)液置37℃ CO2溫箱中培養(yǎng)。

人關(guān)節(jié)軟骨細胞（Cat.No.4650）

4）軟骨細胞培養(yǎng)：

骨細胞內(nèi)含許多細胞因子及其受體，且表明許多細胞因子通過自分泌或旁分泌兩種基本方式來調(diào)節(jié)軟骨細胞。目前認為促進軟骨細胞增殖和基質(zhì)合成代謝的細胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，對軟骨細胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等

體外培養(yǎng)軟骨細胞的優(yōu)點是可以大量擴增及研究其生命活動的狀況，但要維持其正常表型則 受到眾多復(fù)雜因素的調(diào)控。就其細胞因子而言，細胞因子對體外培養(yǎng)軟骨細胞的作用非單一的，而是一個復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，如生長因子的生物學(xué)活性是由受體介導(dǎo)的，生長因子在 軟骨細胞合成分泌后，多為無活性的前體分子需要經(jīng)過特異性的激活才能發(fā)揮作用。生長因 子之間存在基因表達及其活性的相互調(diào)控TGF-β能促進PDGF的A鏈和B鏈的mRNA表達和分泌 ［30］。bFGF能促進TGF-β mRNA的表達，誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞分化成軟骨細胞，增強 TGF對軟骨細胞的增殖及其基質(zhì)合成作用。生長因子之間還存在受體水平的調(diào)控，胰島素不 影響TGF-Ⅱ型受體的親和力但增加了Ⅱ型受體的數(shù)目引起受體上調(diào)效應(yīng)，從而Ⅱ型受體與 Ⅰ型受體競爭，使胰島素與Ⅰ型受體結(jié)合減少。IL-1可使TNF受體下調(diào)，而IFN-γ卻使TNF 受體上調(diào)等。但是生長因子如何調(diào)控體外培養(yǎng)軟骨細胞的增殖、分化阻滯反分化或向肥 大型轉(zhuǎn)化、維持其正常軟骨細胞表型及合成特異性胞外基質(zhì)還需進一步的研究。總之軟骨細 胞體外培養(yǎng)維持其正常表型則受到眾多因素的影響如培養(yǎng)條件及其方式，細胞的微環(huán)境，PH 值、細胞密度、力學(xué)變化、生長因子等等。

5）微載體細胞培養(yǎng)法  
1.微載體選擇：先用利用三種小量微載體做培養(yǎng)實驗，觀察細胞在一定時間內(nèi)細胞的吸著率和計算細胞數(shù)，以得到zui大量細胞為佳。  
2.水化：稱一定量的微載體放入容器中，按每克微載體加50～100ml的比例，加入無Ca2＋和Mg2＋的磷酸緩沖液（PBS），室溫下放置應(yīng)不少于3小時，并不時輕微攪動，然后再用新鮮PBS洗一次。  
3. 消毒：可采用高壓蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用無菌的PBS漂洗一二次。 
4.傳代培養(yǎng)：在連續(xù)進行微載體培養(yǎng)時，可以不必把細胞從微載體分離下來，可將帶有細胞的微載體和新的微載體混合進行培養(yǎng)細胞能移動到新載體上。如果進行其它實驗或需要分離細胞進行傳代培養(yǎng)時，和常規(guī)培養(yǎng)相同，先用EDTA＋*溶液作用使細胞脫離微載體表面。細胞脫離微載體后，可用自然沉降法，即在室溫下靜止5分鐘，微載體將先自沉在底部，細胞大部分仍在上清中，然后離心上清即可得到細胞。如果需要分離程度較高時，需用孔徑為100微米的尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過濾后，再離心濾過液，就可得到較純凈的細胞。