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北京雅安達生物技術有限公司

常用的五種培養(yǎng)動物細胞方法

時間:2013-10-25閱讀:456
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一、半連續(xù)式培養(yǎng)

1.半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應器系統,懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產物形成過程中,每間隔一段時間,從中取出部分培養(yǎng)物,再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積,使反應器內的總體積不變。 這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養(yǎng)基,讓其生長至一定的密度,在細胞生長至zui大密度之前,用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物,每次稀釋反應器培養(yǎng)體積的1/2~3/4,以維持細胞的指數生長狀態(tài),隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加。或者在細胞增長和產物形成過程中,每隔一定時間,定期取出部分培養(yǎng)物,或是條件培養(yǎng)基,或是連同細胞、載體一起取出,然后補加細胞或載體,或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子,繼續(xù)培養(yǎng),從而可維持反復培養(yǎng),而無需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養(yǎng)環(huán)境和相當高的接種量,經過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程,細胞密度常常會提高。

2.半連續(xù)式特點:

·培養(yǎng)物的體積逐步增加;

·可進行多次收獲;

·細胞可持續(xù)指數生長,并可保持產物和細胞在一較高的濃度水平,培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。 該操作方式的優(yōu)點是操作簡便,生產效率高,可長時期進行生產,反復收獲產品,可使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產中被廣泛應用。

二、連續(xù)式培養(yǎng)

1.連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式,采用機械攪拌式生物反應器系統。該模式是將細胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后,為了防止衰退期的出現,在細胞達zui大密度之前,以一定速度向生物反應器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基;同時,含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應器流出,以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講,該過程可無限延續(xù)下去。

2.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點是反應器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定,細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數生長期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)物質濃度、產物濃度、pH值可保持恒定,細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。細胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響,特別是生物反應器的主要營養(yǎng)物質葡萄糖和*,維持在一個較低的水平,從而使他們的利用效率提高,有害產物積累有所減少。然而在高的稀釋率下,雖然死細胞和細胞碎片及時清除,細胞活性高zui終細胞密度得到提高;可是產物卻不斷在稀釋,因而產物濃度并為提高;尤其是細胞和產物不斷的稀釋,營養(yǎng)物質利用率、細胞增長速率和產物生產速率低下。

3.連續(xù)式培養(yǎng)不足:

·由于是開放式操作,加上培養(yǎng)周期較長,容易造成污染;

·在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中,細胞的生長特性以及分泌產物容易變異;

·對設備、儀器的控制技術要求較高。 連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應器多數是攪拌式生物反應器,也可以是管式反應器。

4.連續(xù)式培養(yǎng)的特點:

·細胞維持持續(xù)指數增長;

·產物體積不斷增長;

·可控制衰退期與下降期。

四、灌流式培養(yǎng)

1.灌流式培養(yǎng)是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后,在細胞增長和產物形成過程中,不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出,同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時,絕大部分細胞均保留在反應器內,而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。 灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應器懸浮培養(yǎng)細胞,這種反應器必須具有細胞截流裝置,細胞截留系統開始多采用微孔膜過濾或旋轉膜系統,zui近開發(fā)的有各種形式的沉降系統或透析系統。 中空纖維生物反應器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜,透過小分子量的產物和底物,截流細胞和分子量較大的產物,在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應器內;近年來中空纖維生物反應器被廣泛應用于產物分泌性動物細胞的生產,主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產單克隆抗體。 另外一種形式是固定床或流化床生物反應器,固定床是在反應器中裝配固定的籃筐,中間裝填聚脂纖維載體,細胞可附著在載體上生長,也可固定在載體纖維之間,靠上攪拌中產生的負壓,迫使培養(yǎng)基不斷流經填料,有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞,這種形式的灌流速度較大,細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反應,適合于固定化細胞的培養(yǎng)。

2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點:

·細胞截流系統可使細胞或酶保留在反應器內,維持較高的細胞密度,一般可達107-109/ml,從而較大的提高了產品的產量;

·連續(xù)灌流系統,使細胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中,有害代謝廢物濃度積累較低;

·反應速率容易控制,培養(yǎng)周期較長,可提高生產率,目標產品回收率高;

·產品在罐內停留時間短,可及時回收到低溫下保存,有利于保持產品的活性。 連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動物細胞培養(yǎng)生產分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用連續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法zui大困難是污染機率較高,長期培養(yǎng)中細胞分泌產品的穩(wěn)定性,規(guī)模放大過程中工程問題。

五、細胞工廠培養(yǎng)

細胞工廠(cell factory)是一種設計精巧的細胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內利用了zui大限度的培養(yǎng)表面,從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是,它可有效地保證操作的無菌性,從而避免因污染而帶來的原料、勞務和時間損失。它是對傳統轉瓶培養(yǎng)的革命。 丹麥NUNC公司生產的NUNC細胞工廠是目前應用較多的細胞工廠系統。可用于如疫苗、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產,特別適合于貼壁細胞,也可用于懸浮培養(yǎng),在從實驗室規(guī)模進行放大時不會改變細胞生長的動力學條件,可提供1,2,10和40盤的規(guī)格使放大變得簡單易行,低污染風險,節(jié)省空間,培養(yǎng)表面經測試保證zui有利于細胞貼附和生長。同時,與NUNC的細胞工廠操作儀結合使用,可全面實現細胞培養(yǎng)的自動化,從而大大地減低勞動強度和密集度。 這套系統使用很方便,可產生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚笨乙烯制成,使用后可隨意處理。其zui大缺點是:經*消化后,很難將細胞*洗出。

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